При всей формальности как классификации, так и ее оперирования застывшими множествами объектов, на самом деле в ее основе лежат глубокие принципы способа познания мира человеком, прямо связанные с логикой мышления. Очень давно философы-схоласты задумались об отношении между объектом и словом,
91
его обозначающим, признавая неисчерпанность объекта понятием. При этом в свойствах объекта они выделили две категории: существенные - essentia, и случайные, зависимые - accidentia. Существенные были отнесены к родовым, а случайные зависимые - к видовым категориям, обозначаемым прилагательными. Так произошла бинарная номенклатура Линнея. Классификация биологических объектов по таким правилам получила название систематики.
Используя набор признаков для описания объектов, мы, по сути дела, классифицируем не сами объекты, а их образы, в нашем сознании представляющие понятия. Понятия реализуются в общении как слова, служащие кратким обозначением классов эквивалентности. Отсюда биоразнообразие запечатлевается в сознании как часть лингвистики, причем классы эквивалентности в понятиях носят название таксонов, а вся наука о разбиении множества образов живых существ называется таксономией. Способ описания биоразнообразия сводится к науке о словах, обозначающих классы живых объектов, - номенклатуре. В ней употребляются две категории слов.
Одна служит для обозначения ранга общности классов эквивалентности на множествах: вид, род, семейство, порядок, класс. Правила обозначения получили название Кодексов номенклатуры отдельных для животных, растений, бактерий. В настоящее время разрабатывается единый кодекс номенклатуры, получивший название Биокодекса. Ранги классов эквивалентности получили в нем узаконенные обозначения для всех живых существ. В иерархической системе биологической номенклатуры различаются следующие ранги в порядке нисходящей последовательности: царство (Regnum), отдел (Phylum), класс (Classis), порядок (Ordo), семейство (Familia), род (Genus), вид (Species). (Проект Биокодекса. Статья 3.1.)
Вторая категория слов служит для обозначения самого объекта биоразнообразия. В обозначении объектов живой природы сосуществуют две номенклатуры. Одна из них тривиальная и подчиняется правилам местного языка (рябчик, черемуха), а другая научная. Они различаются по написанию: тривиальная пишется по правилам национального правописания и грамматики, а научная - по-латыни. При этом возможна путаница. Например, в тривиальном
92
понимании "бактерии" - это эквивалент прокариот вообще, а в научной терминологии "Eubacteria" обозначает одну группу прокариот, противопоставляемую "Archaebacteria", представителей которых иногда обозначают словом "археон" или "архея". Путаницы от этого много, а смысла мало, поскольку резкое противопоставление между этими двумя группами прокариот, в отличие от противопоставления между прокариотами и эукариотами, имеет значение прежде всего в классификации по молекулярным признакам, но не по строению клетки или функционированию в природе. Связана эта настойчивость с приданием приоритета определенной категории признаков, важных для установления филогении, или генеалогии, которая считается основой научной классификации по порядку или последовательности происхождения. Для прокариот порядок происхождения выводится на основе молекулярных признаков и служит для филогенетической классификации.
Для читателя не-биолога полезно помнить, что всякая классификация понятий - искусственна и предназначена для решения определенных задач. В общей микробиологии было введено в конце XIX века понятие рода бактерий как морфо-физиологического единства, отразившееся в названиях Nitrosomonas, Azoto-bacter, Desulfovibrio, Methanosarcina. Этот подход был очень продуктивным, потому что название отражало функциональные характеристики организма, и такой традиции стараются придерживаться в общей микробиологии. Напротив, в медицинской микробиологии господствовала традиция названия по имени ученого с видовым обозначением по инфекционности, например Pasteurella pestis, Escherichia coli.
Правила номенклатуры строго регламентированы "Кодексами номенклатуры": зоологическим, ботаническим, бактериологическим. Сходные кодексы имеются и для других объектов природы, например, минералов, пород, и для каждой категории существуют свои нормы классификации, которые в принципе основываются на иерархическом подходе - последовательном разбиении на подмножества. Такое построение допускает два способа построения: сверху вниз от общего к частному или снизу вверх от частного, точнее индивидуального, к общему. Эти два способа существенно различны.
93
При движении сверху вниз мы следуем дихотомическому разбиению множества понятий по признакам или свойствам, начиная с самых общих: живое или неживое. Уже на этом этапе можно встретиться с большими трудностями, пытаясь отличить минеральную частицу от бактерии. Далее идет отличие прокариот от эукариот, имеющее четкую границу (хиатус) и разделяющее живые организмы на непересекающиеся множества. Помимо прямых различий, входящих в определение компартментализации клетки эукариот, есть набор коррелирующих признаков. Всегда существует тенденция заменить основные признаки коррелирующими, например строение клетки - различиями 16S и 18S рРНК.
Второй способ классификации, типологический, начинается от индивидуального объекта, признаваемого эталоном, и основывается на сравнении его с теми, которые обладают сходством с ним, и на решении, можно ли эти объекты объединить в один класс эквивалентности. Построение классификационной системы снизу вверх в принципе не дает разбиения множества, оставляя часть объектов вне рассмотрения. Вместе с тем при таком подходе признается существование множества неизвестных объектов, определить положение которых можно только путем сопоставления с уже известными. Этот способ классификации принят сейчас в биологии. Первый опознанный организм нового сорта признается типовым.
Принципы классификации биологических объектов следующие (Проект Биокодекса: будущие международные правила для научных названий организмов. СПб., 1997):
- Принцип I. Биокодекс регулирует образование и выбор научных названий известных таксонов, но не само определение таксонов. Настоящий Кодекс не содержит ничего, что можно истолковать как ограничение свободы таксономической мысли или действия.
- Принцип II. Научная номенклатура организмов строится на линнеевской системе бинарных названий видов.
- Принцип III. Применение названий таксонов определяется посредством номенклатурных типов, хотя действие этого принципа не универсально для таксонов в ранге выше семейства.
- Принцип IV. Номенклатура таксонов основана на приоритете обнародования, хотя применение этого принципа не обязательно во всех рангах.
94
- Принцип V. Каждый таксон в группе семейства, в родовой группе или в видовой группе с определенными границами, положением и рангом имеет только одно принятое название, за исключением случаев, особо оговоренных в более ранних Кодексах.
- Принцип VI. Научные названия таксонов традиционно рассматриваются как являющиеся латинскими, независимо от их происхождения.
- Принцип VII. Единственно вескими основаниями для перемены названия являются или изменение границ, положения или ранга таксона в результате соответствующего таксономического исследования, или необходимость обеспечения номенклатурной стабильности.
- Принцип VIII. При отсутствии подходящего правила или сомнительности выводов, необходимо следовать установившейся традиции.
- Принцип IX. Правила номенклатуры имеют обратную силу, если только специально не ограничены.
Применение Принципов регулируется Правилами. Важнейшие из них приводятся ниже:
Определение приоритета названия, согласно Принципу IV, регулируется ст. 5: "Обнародование, согласно настоящему Кодексу, определяется как распространение текста или изображений (но не акустической записи) в нескольких идентичных долговечных и неизменяемых копиях посредством продажи, обмена или дара, чтобы сделать их широко доступными научному сообществу в качестве постоянного общественного документа, подлежащего ограничениям и определениям настоящей статьи".
Согласно ст. 8.1: "Для того чтобы быть установленным, название таксона, начиная с 1 января 2000 г., должно: (а) быть обнародовано, как предусмотрено ст. 7, 5-6; (в) иметь форму, соответствующую ст. 25-33; (с) должно быть принято автором (авторами), который(-ые) является авторами названия; (d) не быть предложенным заранее, на случай принятия в будущем данной группы в целом или в определенных границах, положении или ранге; (е) соответствовать специальным положениям ст. 9-12 (см. также ст. 38.3). Кроме того, название должно быть зарегистрировано согласно ст. 13".
В бактериологии датой законного опубликования являлась дата опубликования названия (а не получения рукописи редакцией!) в International Journal of Systematic and Evolutionary Bacteriology. Согласно новому правилу 13.2, датой регистрации явится дата получения соответствующих материалов регистрационным бюро.
95
В соответствии с Принципом III Правило 10 устанавливает, что "название нового таксона в ранге рода или ниже рода не может быть установленным без обозначения номенклатурного типа (см. ст. 14-17)" и "при названии нового вида или внутривидового таксона, голотипом которого является сохраняемый экземпляр, следует указать учереждение или коллекцию, в которой этот тип хранится". По ст. 14.2: "Номенклатурный тип - это тот элемент, с которым постоянно связывается название таксона, независимо от того, принятое ли это название или нет". По ст. 15: "Для названий надвидов, видов или внутривидовых таксонов номенклатурный тип - это экземпляр (но если сохранить образец невозможно, то типом, по ст. 15.3, может служить иллюстрация; кодекс пока не предусматривает вместо иллюстрации последовательность нуклеотидов, как это предложено бактериологами для категории Candidatus). Экземпляр, как он определен здесь, обычно состоит из одной особи или ее частей, но может иногда состоять из более чем одной особи или частей разных особей (при условии, что все они являются одним и тем же таксоном), собранным или изолированным в одно и то же время в одном и том же месте; этот экземпляр постоянно сохраняется как отдельная единица хранения (например, в виде гербарного листа или препарата)". Ст. 15.2: "Типовыми экземплярами не могут быть метаболически активные организмы, но могут быть организмы, постоянно сохраняемые в живом, но метаболически неактивном состоянии, например, посредством лиофилизации или криосо-хранения".
Правила номенклатуры требуют строгого их соблюдения, в противном случае приоритет названия теряется. Следует исходить из предположения, что когда-то кем-то будут приложены все усилия, чтобы оспорить приоритет, в том числе и посредством обыкновенного сутяжничества. Поэтому соблюдение юридических правил номенклатуры, изложенных в Международном кодексе по номенклатуре бактерий, представляет технику юридической безопасности для исследователей микробного разнообразия. Изменение названия путем введения синонимов ведет к потере возможности найти первоначальные сведения, которые содержат базовую информацию, позволившую выделить данный объект.
96
Для пользователей данными систематики бактерий важно сразу же составить список синонимов своих объектов.
Принципиальным требованием классификации на основе типизации служит доступность эталона для сравнения. Сохранение эталона дает возможность вернуться к его исследованию с целью установления признаков, ставших доступными с развитием новых методов; ярким примером может служить переисследование разнообразия бактерий с целью установления последовательности нуклеотидов. Принципиальным ограничением классификации на основе типизации служит исследование единичного экземпляра и, следовательно, игнорирование природной вариабельности. Поскольку сравнение бактерий проводилось по их химической активности, то была необходима чистая живая культура. По новым правилам "культура, поддерживаемая пересевами в лаборатории автора названия, более не может служить номенклатурным типом". Поэтому были созданы коллекции типовых культур бактерий, сначала в США - АТСС (American Type Culture Collection), потом в Германии DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen), в СССР - BKM (Всесоюзная, ныне Всероссийская, Коллекция Микроорганизмов), где культуры сохраняются в лиофилизированном виде или в жидком азоте. Обладание такой коллекцией дает стране необычайные преимущества - она располагает всеми генетическими ресурсами микробного разнообразия в мире, и результат колоссального труда по выделению, характеристике микроорганизмов бесплатно передается стране-обладателю коллекции, причем приходится добиваться права быть включенным в каталог коллекции и получить номер типового штамма. Страна-обладатель коллекции несет большие затраты по поддержанию культур в живом, но не размножающемся, виде. Это требует большого искусства и умения манипулировать с самыми разными организмами. Поэтому от умелых рук и интуиции здесь зависит очень многое. Успех связан с особым характером, вниманием и терпеливостью, как у садовника. Такими качествами должен обладать каждый микробиолог, работающий с биоразнообразием, и поэтому в большой практикум германских университетов включают задачи по выделению или культивированию недавно описанных организмов, где приходится отклоняться от рутинной работы с биомассой или мутантами на чашках (в стиле "pick up
97
the colony"). Здесь проходит резкая граница между "химиками" и "ботаниками" по характеру. Следует запомнить, что основателями общей микробиологии как науки о невидимых катализаторах природных процессов были не химики, а ботаники С.Н. Виноградский и М. Бейеринк.
Возвращаясь к принципу классификации по эталону, следует сказать, что он дает возможность сравнивать объекты, не перечисляя их признаки, по общему сходству, как "finger print" или "pattern", т.е. не переводя их в понятия, не внося смысла в операцию сравнения. Эта бессмысленная ("объективная") классификация сначала устанавливает сходство или отсутствие его и лишь затем следует смысловой анализ, часто заменяемый статистикой. На этом основана классификация по хемотаксономическим показателям, иммунодиагностика, но более всего определение ДНК-ДНК-гомологии - аналитическое определение сходства ДНК двух организмов. Принимается, что организмы, различающиеся по ДНК-ДНК-гомологии менее чем на 30%, принадлежат к одному виду. О свойствах организмов эти данные ничего не говорят, но надежно устанавливают эквивалентность, а особенно идентичность сравниваемых объектов. Методы иммунодиагностики служат примером идентификации, основанной на попарном (бинарном) сравнении объектов без анализа их свойств. Попарное сравнение дает качественный ответ "сходен" - "нет". Количественная оценка сходства требует сравнения по числу совпадений в дискретных признаках.
Молекулярная биология дала возможность сравнивать организмы по последовательности нуклеотидов. Для этого был выбран ген 16S рДНК как наиболее удаленный от функциональных зависимостей, связанных с условиями обитания, и целиком находящийся во внутренней сфере организма. Технически он удобен, поскольку содержит 1500 пар оснований, что находится в пределах возможностей анализа как химического, так и статистического. Фактически организм здесь отсутствует, а последовательность нуклеотидов дает "номер паспорта". Такого рода запись удобна для математической операции сравнения сходства и представления его в виде графа дерева, имеющего внешнее подобие с генеалогическим деревом. Операции сравнения таких больших последовательностей
98
стали возможны с применением компьютерных программ, позволяющих построить результаты сравнения в виде графов сходства. Эти графы имеют внешнее подобие и с дихотомическими деревьями, получаемыми в определительных ключах при разбиении множества понятий по признакам. Сейчас проанализированы последовательности 16S рРНК почти 5 тысяч видов бактерий. Принято, что при различии более 5% в последовательности организмы принадлежат разным родам. При оценке деревьев следует помнить, что они относятся к одному гену со специальной функцией в синтезе белка. Полное сравнение генома требует анализа примерно 4 млн пар оснований в ДНК и пока проведено для более двух десятков видов с опасностью избыточной информации при сравнении общего сходства. Вместе с тем именно на ДНК можно идентифицировать участки, соответствующие функционально значимым генам.
В результате массовой работы по сравнению 16S рРНК были построены деревья сходства, устанавливающие на множестве последовательностей нуклеотидов РНК малой субъединицы рибосомы порядок, которому приписывается соответствие последовательности происхождения организмов, исходя из предположения, что замены нуклеотидов происходили случайно во времени и этим заменам можно приписать временную характеристику. Полученные филогенетические деревья рассматриваются как наиболее строгое доказательство генеалогии, и вскоре стали считать, что филогения прокариот наиболее обоснована с дарвинистских позиций. Результаты массовых работ по определению последовательностей нуклеотидов как у чистых культур, так и природных популяций привели к следующим выводам.
Между положением на дереве сходства последовательностей рибосомального гена и фенотипической системой существует общая корреляция с выделением крупных ветвей грамположитель-ных бактерий, грамотрицательных протеобактерий, цианобактерий и ряда более мелких ветвей, особенно термофильных. Наиболее крупным делением прокариот явились ветви собственно бактерий Eubacteria и архебактерий Archaeobacteria. Для эукариот, составляющих отдельную ветвь, было установлено, что митохондрии принадлежат ветви протеобактерий, а хлоропласты -
99
цианобактерий, доказывая симбиогенетическое происхождение всех эукариот.
Дальнейшая детализация корреляции приводит ко все большим расхождениям между функциональными характеристиками и положением на дереве. Многие группы функциональной классификационной системы оказываются принадлежащими разным ветвям. Здесь возможны две интерпретации. Одна из них восходит к представлениям А.Л. Тахтаджяна о гетероботмии - неравномерной и частично независимой эволюции органов организма, - приложимой и к рибосоме, самостоятельную эволюцию которой отражает последовательность 16S рРНК. Вторая концепция связана с представлением о горизонтальном (латеральном) переносе генов, причем особое значение придается функционально значимым генам, составляющим относительно небольшую часть генома.
Наиболее ошеломляющие результаты дало широкое применение метода идентификации объектов по 16S рРНК к природным сообществам. Исследование биоразнообразия в природе (in situ), в отличие от чистой культуры (ex situ), проводится на основе экстракции суммарной ДНК из образца, очистки, амплификации, получения генов рРНК, их секвенирования и сопоставления с имеющимся компьютерным банком данных. Таких исследований сейчас очень много и они позволяют вести мониторинг сложных микробных сообществ с идентификацией клонов рДНК-гена. Другой прием заключается в применении генных проб, позволяющих сразу же установить принадлежность организмов к той или иной ветви.
В качестве примера были выбраны сообщества экстремальных местообитаний: термальных источников, гиперсоленых лагун. В таких местообитаниях культуральные методы и прямое наблюдение за морфологически идентифицируемыми in situ организмами, например цианобактериями, обнаруживает ограниченное биоразнообразие. Применение идентификации по 16S рРНК к природным популяциям показало, что даже в этих случаях минимального разнообразия генетически определяются не те организмы, которые есть в культурах. Известные по коллекциям культур гены 16S рДНК либо отсутствуют, либо присутствуют в
100
минимальном количестве среди новых, отсутствующих в культурах организмов. Например, среди архебактерий в термальных источниках Японии обнаруживают клоны ДНК, отличные не только от последовательностей, известных для культивируемых архебактерий, но и от клонов, последовательности в которых были установлены в других термальных источниках, например, Америки. В результате возникает чрезмерное разнообразие, которое пока не удается привести в единую систему. Создается впечатление, что разнообразие бактерий по одному гену малой рибосомальной субъединицы гораздо больше разнообразия, установленного по функциональным характеристикам. Мало надежды и на полное секвенирование ДНК с установлением функционально значимых генов: вполне может возникнуть ситуация комбинаторики по тысяче признаков.
Общий вывод этих исследований таков: в природе есть множество объектов, которые не могут быть сопоставлены с известными; организмы, выделенные в чистую культуру, в природе немногочисленны. Следовательно, культуральные методы вносят систематическую ошибку в познание биоразнообразия микробного мира, и вся концепция валидации на основе тезиса "чистая культура в признанной коллекции" потерпела крах: можно сказать и трудно опровергнуть, что существующая таксономия бактерий, как она представлена в Определителях Берджи на основании узаконенных в соответствии с Кодексом номенклатуры бактерий, есть "классификация артефактов".
Для микробиологов, пользовавшихся прямыми методами, например микроскопией природного материала, подобно протистологам, этот вывод не стал неожиданностью. Начиная с Ф. Кона (F. Cohn), описывавшего крупные водные микроорганизмы, и до Д.И. Никитина, использовавшего электронную микроскопию для описания необычных форм, известно, что организмы, доминирующие в "микробных пейзажах", не являются теми, которые попадают в пробирки. Однако торжество микроскопистов над кулыуралистами очень относительно. Исследуя цианобактерии Synechococcus в термальном источнике, Д. Вард (D. Ward) нашел, что генетически идентифицируемые клоны отличаются и от культивируемых штаммов, и от распознаваемых микроскопически
101
форм. Аналогичные результаты были получены с галофильными архебактериями в гиперсоленых лагунах.
Итак, важнейшим фактом экологии бактерий в настоящий момент является разрыв между генетически идентифицируемым множеством объектов в природных местообитаниях и множеством узаконенных лабораторных культур с известными морфо-физиологическими характеристиками. Выход из кризиса состоит в необходимости перехода от геномных характеристик к функциональным. В принципе такой переход возможен и начинает развиваться на основе идентификации генов в ДНК, но он еще требует длительного накопления материала.
В заключение следует подчеркнуть, что всякая классификация строится для достижения определенной цели, которой служит в науке познание закономерностей. Одно и то же множество объектов может быть классифицировано разными способами в соответствии с многомерностью свойств объектов. В этом отношении для познания роли бактерий в природе их классификация на основе морфо-физиологических родов оказалась чрезвычайно удобной, потому что она соответствовала их функциональной роли в природных процессах. Современное понимание биосферной системы основано на биогеохимических циклах, которые сформировались в истории Земли при каталитической роли бактерий задолго до появления каких-либо иных организмов и поэтому остаются базовыми.
Для использования знаний о биоразнообразии микроорганизмов необходимо знание разных классификаций, которые в немногих терминах позволяют описать существенные свойства объектов исследования. Применительно к задачам исследования приходится опираться на ту или иную классификацию.
102